酵母は厚い細胞壁に覆われているため、細胞を効率的に破砕する必要があります。
当社の一液タイプのRNA抽出試薬（ISOGEN / ISOGEN-LS）では、酵素（Zymolyase）を併用するオプションプロトコールをご用意しております。
一方、スピンカラムを使用するキットでは、これまで酵母からのRNA抽出実績がありませんでした。
そこで今回、当社のキットとZymolyaseを組み合わせることで、高品質なRNAが得られるかを検証しました。
参考リンク： ISOGEN／ISOGEN-LSを用いた酵母からのRNA抽出はこちら
目次
材料
①Pichia酵母（Komagataella pastoris）
- 液体培地で培養したPichia酵母（OD = 0.6程度）を約20 mL回収
- 1.5 mLチューブに1.2 mLごとに分注し、遠心
- 上清を除去後、-80℃に保存
②ドライイースト（Saccharomyces cerevisiae）
- YPD培地50 mL（200 mL容量の三角フラスコ）にドライイースト1袋を投入し、30℃で20分培養（ローテーター 120 rpm）
- 新しいYPD培地50 mL（200 mL容量の三角フラスコ）に先の培養液50 µLを添加し、30℃で培養（ローテーター 120 rpm）
- オーバーナイトで培養後、培養液を回収し、1.2 mLずつ分注
- 遠心（13,000 × g、5分、4℃）で培地を除去
- 沈殿に氷冷Milli-Q水1 mLを加え、ピペッティング後再度遠心（同条件）
- 上清を除去し、-80℃で保存
使用したキット＆方法
- ISOGEN
- ISOGEN ＋ Beads Beat
- ISOGEN ＋ 液体窒素
- ISOSPIN Plant RNA
- ISOSPIN Plant RNA ＋ Beads Beat
- ISOSPIN Plant RNA ＋ 液体窒素
- ISOSPIN Plant RNA ＋ 酵素（Zymolyase、反応時間 10分） ※
- ISOSPIN Plant RNA ＋ 酵素（Zymolyase、反応時間 1時間） ※
※スタート試料量：Pichia酵母は他条件の1/4、ドライイーストは他条件の1/3で検討。事前準備：Zymolyase buffer（0.9 M Sorbitol、0.1 M EDTA、50 mM DTT［pH 7.5］）を調製し、0.2 µmフィルターで滅菌。
結果
各条件の吸光度測定結果を以下の表に示します。
①Pichia酵母（Komagataella pastoris）
| 抽出試薬 | 収量(ng/μL) | A260/A280 | A260/A230 |
| 1.ISOGEN | 未検討 | ||
| 2.ISOGEN ＋ Beads Beat | 未検討 | ||
| 3.ISOGEN ＋ 液体窒素 | 1122.9 ng/μL | 2.22 | 2.50 |
| 4.ISOSPIN Plant RNA | 2.41 ng/μL | 1.78 | 0.57 |
| 5.ISOSPIN Plant RNA ＋ Beads Beat | 278.3 ng/μL | 2.23 | 2.45 |
| 6.ISOSPIN Plant RNA ＋ 液体窒素 | 1172.2 ng/μL | 2.27 | 2.50 |
| 7.ISOSPIN Plant RNA ＋ 酵素 （Zymolyase、反応時間 10分） ※スタート試料量は他の1/4量で検討 | 16.42 ng/μL | 1.90 | 1.61 |
| 8.ISOSPIN Plant RNA ＋ 酵素 （Zymolyase、反応時間 1時間） ※スタート試料量は他の1/4量で検討 | 109.9 ng/μL | 2.18 | 2.25 |
②ドライイースト（Saccharomyces cerevisiae)
| 抽出試薬 | 収量(ng/μL) | A260/A280 | A260/A230 |
| 1.ISOGEN | 21.7 ng/μL | 2.17 | 1.31 |
| 2.ISOGEN ＋ Beads Beat | 3627.4 ng/μL | 2.22 | 2.59 |
| 3.ISOGEN ＋ 液体窒素 | 2073.7 ng/μL | 2.24 | 2.65 |
| 4.ISOSPIN Plant RNA | 1.71 ng/μL | 4.75 | 0.70 |
| 5.ISOSPIN Plant RNA ＋ Beads Beat | 86.38 ng/μL | 2.20 | 2.32 |
| 6.ISOSPIN Plant RNA ＋ 液体窒素 | 1150.1 ng/μL | 2.30 | 2.56 |
| 7.ISOSPIN Plant RNA ＋ 酵素 （Zymolyase反応時間 10分） ※スタート試料量は他の1/3量で検討 | 977.7 ng/μL | 2.25 | 2.40 |
| 8.ISOSPIN Plant RNA ＋ 酵素 （Zymolyase、反応時間 1時間） ※スタート試料量は他の1/3量で検討 | 1146.3 ng/μL | 2.27 | 2.40 |
まとめ
- ドライイーストでは、ISOSPIN Plant RNAとZymolyaseの併用により、高収量のRNAを得ることができました。
- 一方、Pichia酵母では、Zymolyaseによる効果は確認できませんでした。